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生物工程下游技术,涉及固液分离、全发酵液提取等技术和设备

2021/4/12



从古至今,人类都没有放弃对发酵工程的研究,在现代生物工程技术中它是一种“旧改新”的技术,同时生物分离也是生物产品产业化的必经之路,分离效率直接决定产品的生产成本,因此生物工业下游技术的发展日益受到研究者的重视。


从广义上讲,发酵工程由三部分组成:上游工程,发酵工程和下游工程。其中,下游工程指从发酵液中分离和纯化产品的技术:包括固液分离技术(离心分离,过滤分离,沉淀分离等工艺);细胞破壁技术(超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等);蛋白质纯化技术(沉淀法、色谱分离法和超滤法等)。


因而,如何从混合原料中高效、快速、特异捕获目标物质是下游技术的首要解决问题?本文对其中的固液分离技术的原理、方法和设备做一综述。

1、目标物在胞内,通过固液分离才可以收集胞内产物的细胞或菌体,除去液相;

2、分离除去细胞碎片、获得胞内的目标物;

3、目标物在液相,通过固液分离收集含生化物质的液相,除去固体悬浮物,如细胞、菌体、细胞碎片,蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等(比如抗生素等小分子的分离)。

1、传统的固液分离适用于物理状态不同的固液混合体;

2、从发酵液中除去菌体细胞;

3、除去细胞裂解后的细胞碎片;

4、沉淀出的蛋白质或其它无机盐等物质;

5、因而有时需要通过凝聚或絮凝等创设条作加固形物。同时,也降低了粘度;

6、现在基于粒度不同:膜技术、双水相萃取、扩张床吸附等。

从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的重要步骤就是预处理和固液分离。其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒,还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质,以利于后续的各步操作。

对发酵液进行预处理可以促进从悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离的效率:

加热法:加热可降低液体的黏度,根据流体力学的原理,滤液通过滤饼的速率与液体的黏度成反比,可见降低液体黏度可有效提高过滤速率;同时,在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚,形成较大颗粒的凝聚物,进一步改善了发酵液的过滤特性。例如,链霉素发酵液,调酸至PH3.0后,加热至70℃,维持半小时,其黏度下降至原来的1/6,过滤速率可增大10~100倍。

调节悬浮液的PH值:PH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质,因此适当调节发酵液的PH值可改善其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。

凝聚和絮凝:凝聚和絮凝都是悬浮液预处理的重要方法,其处理过程就是将化学药剂预先加入到悬浮液中,改变细胞、细胞碎片、菌体和Pro等胶体粒子的分散状态,破坏其稳定性,使其凝结成较大的颗粒,便于提高过滤速率,而且能有效地除去杂蛋白和固体杂质,提高滤液质量。但凝聚和絮凝是两种不同方法,其具体处理过程还是有差别的,应该明确区分开来,不可混淆。


(1)凝聚:指向胶体悬浮液中加入某种电解质,在电解质异电离子作用下,胶体粒子的双电层电位降低,从而使胶体失去稳定性并使粒子相互凝聚成1mm左右大小的块状凝聚体的过程。

(2)絮凝:指使用絮凝剂将胶体粒子交联成网,形成10mm左右大小的絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。采用凝聚方法得到的凝聚体,其颗粒常常只有1mm左右,比较细小,有时还不能有效地进行分离。而采用絮凝方法则常可形成粗大的絮凝体(10mm左右),使发酵液较容易分离。



添加助滤剂:助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒,它能使滤饼疏松,滤速增大。这是因为使用助滤剂后,悬浮液中大量的细微粒子被吸附到助滤剂的表面上,从而改变了滤饼结构,使滤饼的可压缩性下降,过滤阻力降低。


常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒和淀粉等。

添加反应剂:通过添加一些不影响目的产物的反应剂,可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响,从而提高过滤速率。加入的反应剂与某些可溶性盐类发生反应,生成不溶性沉淀,如CaSO4、 AlPO4等。

添加草酸盐除去高价无机离子:主要是Ca2+、Mg2+和Fe2+等。

沉淀法:Pro是两性物质,在酸性溶液中,能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等形成沉淀,在碱性溶液中,能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。

变性法:其中最常用的是加热法,还有大幅度调节PH,加酒精、丙酮等有机溶剂或一些表面活性剂等方法。

吸附法:加入某些吸附剂吸附杂蛋白而将其除去。

固液分离是生物产品生产中经常遇到的重要单元操作,固液分离可以收集胞内产物的细胞或菌体,分离除去液相;还可以收集含生化物质的液相,分离除去固体悬浮物(细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等)。

因此,培养基、发酵液、某些中间产品和半成品等都需要进行固液分离,其方法很多,传统的方法是过滤和离心;现代一种全新的生物分离技术被提出,即全发酵液提取,主要用到的方法有膜技术、双水相萃取、扩张床吸附。

过滤操作是借助于过滤介质,在一定的压力差△p作用下,使悬浮液中的液体通过介质的孔道,而固体颗粒被截留在介质上,从而实现固液分离的单元操作。

(1)过滤介质

织物介质:又称滤布,应用最广泛,包括由棉、麻等天然纤维滤布和合成纤维滤布;

粒子介质:有硅藻土、珍珠岩粉、细砂、活性炭、白土等;

多孔固体介质:如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等,可加工成板状或管状,孔隙很小且耐腐蚀,常用于过滤含有少量微粒的悬浮液。

(2)常用设备

△按操作方式分类:间歇过滤机、连续过滤机

△按操作压强差分类:压滤、吸滤和离心过滤

板框压滤机(间歇操作):板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、 放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。

转筒真空过滤机(连续操作):工业上应用最广的一种连续操作的过滤设备。转筒真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再生连续化操作,生产能力大,劳动强度小。其主要适用霉菌发酵液,对菌体细小、黏度大铺助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较差。
过滤式离心机:离心过滤是指藉旋转液体所受到的离心力而通过介质和滤饼、固体颗粒被截留于过滤介质表面的操作过程。离心过滤的推动力即离心力。
对于浓度较小,粒径较大,硬度较强的不溶物,可以采用过滤分离。但当固体颗粒细小而难以过滤时,发酵液不易被过滤纯化,离心操作往显得十分有效。

离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异,在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。一般动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。

利用离心机高速旋转产生的离心力来实现分离,具有分离速度快、分离效率高,液相澄清度好等优点;缺点是设备投资高、能耗大,此外,连续排料时,固相干度不如过滤设备。离心机的样式有:斜角式、平抛式、管式、蝶式、螺旋式、多室式。

两种或两种以上的单元操作进行有效的组合,组成一种有效的单元操作,以达到提高产品收率、缩短纯化步骤、降低纯化费用和投资成本的目的。

(1)膜技术

采用膜直接吸附法,经一步分离就可达到过滤、浓缩和初步纯化的效果。该技术的关键在于膜上连接的配基数量要大,同时必须解决膜孔道的污染问题。

(2)双水相萃取

向水相中加入溶于水的某些高分子化合物(如葡聚糖、聚乙醇等)后,形成密度不同的两相,轻相中富含某种高分子化合物,重相中富含盐类或另种高分子化合物,从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。

(3)扩张床吸附

向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂,或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床,即可达到除去细胞碎片的目的。主要的问题是很难选择合适的吸附剂,以保证目的产物不被吸附而损失。

由于扩张床吸附层析技术具有集成化分离的优点,分离周期短,成本低,在生物产品的分离中应用广泛,特别适用于含有细胞等固体粒子的粗制品的分离。同时扩张床介质的配基主要是离子交换配基、疏水配基以及亲和配基,由此,决定了该技术不再局限于蛋白质分离,即扩张床技术的应用领域在日益扩大。发酵液的分离纯化技术,在生物工程产品的下游处理过程中有十分广阔的应用前景,目前通过我国科研人员不断研究、消化、吸收国内外同类产品优质技术,我国的固液分离设备在结构形式、分离效率、自动化水平、功能集成、产品质量和可靠性方面已经有了质的飞跃,近年来在各行各业中不断地被广泛应用。


随着科技的不断发展,无论是固液分离技术还是设备,我国都将快速缩短与欧美发达国家的差距。


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